前 言
摄食是人类以及动物维持生命活动的最基本和最重要的行为。摄食控制是一个复杂的过程,这一过程的精确调节方式大多仍为未知。研究表明,摄食不仅与环境、心理密切相关,还受体内复杂的神经和体液因素的调节,涉及到神经中枢、传入、传出神经以及许多同摄食有关的信号、神经递质和激素,而中枢神经系统(CNS)是控制摄食的主要部位。许多资料提示多种神经递质参与下丘脑功能及摄食行为的调节,下丘脑存在调节摄食和能量代谢的网络环路。这个由多种成分组成的摄食调节网络,一旦受到损害将导致多食、体重增加或厌食、体重下降。
摄食障碍(eating disorders,EDS)以严重异常的进食行为为特征,多见于青少年,女性居多,男性发病较少,流行病学资料显示普通人群中EDS的患病率约0.5%-3%,男性仅占5%。摄食障碍是一种比较特别的精神疾病,患者具有与其它精神疾病无关的进食习惯或控制体重的异常行为,并导致严重的生理障碍。无论男性还是女性患者,害怕发胖和对体型、对体重的歪曲的认识与期望是他们共同的重要的心理病理特点。EDS可分为神经性厌食症((anorexia nervosa,AN )、神经性贪食症(bulimia nervosa,BN )、不典型摄食障碍(atypital eating disorder)和暴食症(binge eating disorder, BED )四大类。在西方,摄食障碍是一个直接威胁青少年及青年人的身心健康的严重的社会问题,EDS也曾被认为是西方国家特有的疾病,但近年来日本、新加坡、以色列和中国的关于EDS的研究日益增多。国内对上海、重庆大学生的有关研究发现,女大学生中AN的患病率达1.1%,与西方国家的报道相近。环境因素与遗传因素被认为在EDS的发病中起重要作用,长期以来人们认为EDS主要与精神因素与文化背景有关,但通过大量遗传学和分子生物学研究,人们已逐步认识到基因在EDS中的重要地位。
另一方面,随着经济的发展、生活水平的不断提高,超重和肥胖正日益成为影响生命健康的一大公害,有资料报道体重指数(body mass index, BMI)和总死亡呈“U”形或“J”形关系,即BMI过高或过低总死亡率均升高。世界卫生组织将BMI≥25kg/m2定义为超重,BMI≥30kg/m2定义为肥胖。虽然我国BMI低于西方人群,但近20年来随着社会的发展,成人体重指数均值和超重率呈现显著上升趋势。2002年中国肥胖问题工作组提出中国成人适宜体质指数切点,BMI≥24kg/m2为超重,BMI≥28kg/m2为肥胖。目前认为超重和肥胖是现代社会中最常见的营养障碍性疾病,它与环境(包括社会和文化环境)、基因、新陈代谢、行为和心理等因素密切相关,其最大危害是引发各种各样的并发症和合并症,如心脑血管疾病、糖尿病、高血压及内分泌疾病等。肥胖的发病机制一直是医学研究的热点和难点。
1994年Zhang等首先从遗传性肥胖小鼠(ob小鼠)中克隆出ob基因,将人类对摄食和能量代谢的研究推进到分子水平。瘦素是肥胖基因(ob基因)的产物,它可使摄食减少、体重减轻、基础代谢率升高,从而致体重减轻。瘦素由脂肪组织分泌,经血循环通过血脑屏障作用于中枢神经系统,与下丘脑弓状核(ARC)的瘦素受体结合以调节能量代谢。ARC的豚鼠相关蛋白(agouti-related protein, AGRP)神经元和阿片促黑素皮质(POMC)上有瘦素受体表达,瘦素可抑制AGRP神经元活性,也可上调POMC神经元的活性。POMC裂解成为MC系统,是MC受体激动剂,其中MSH可与MC3-R、MC4-R结合,抑制食物摄入并增加能量消耗。AGRP可与下丘脑MC3-R、MC4-R结合,是MC受体的竞争性拮抗剂,阻遏了α-MSH的作用,引起食欲增强及肥胖。动物实验已证实AGRP是一种重要的食欲肽。Vink 等报道hAGRP基因760G→A 多态性与EDS中的AN有关,而Argyropoulos等报道760G→A 可使蛋白质的二级结构发生改变,G/G基因型与成人肥胖密切相关。有鉴于此,我们就AGRP760G/A基因多态性与摄食和能量代谢,即与神经性厌食及超重和肥胖的关系进行研究。
基因多态性与肥胖相关性探讨
第一部分 人类豚鼠相关蛋白目的 探讨超重和肥胖与人类豚鼠相关蛋白(hAGRP)基因760G/A多态性的相关性。
方法 采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的方法,对135例超重和肥胖者及98例对照组提取DNA并检测hAGRP的基因型和等位基因。测定血清空腹血糖(FBS)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白A(apoA)及载脂蛋白B(apoB)等水平。
结果 总研究人群中hAGRP基因的760A和760G两种等位基因分布频率为2.79%和97.21%;超重和肥胖组G/G基因型及G等位基因频率较对照组增加(P<0.05),血清FBS、TC、TG和apoB水平高于对照组(P<0.05),超重和肥胖患者BMI与FBS、TG呈正相关。
结论 hAGRP基因的760G/A多态性与肥胖相关,且在成人肥胖发展过程中起作用。
【关键词】人类豚鼠相关蛋白 肥胖 基因多态性
前 言
肥胖是一种与环境(包括社会和文化环境)、基因、新陈代谢、行为和心理等相关的复杂、多因素的慢性疾病,早在1948年世界卫生组织就将肥胖列入疾病名单,其最大危害是引发各种各样的并发症和合并症,如心脑血管疾病、糖尿病、高血压及内分泌疾病等。超重和肥胖在一些发达和地区人群中的患病情况已呈流行趋势,近20年来随着社会的发展,我国人群中肥胖比率显著上升,目前体重超重者已达22.4%,肥胖者3.01%,超重和肥胖已成为现代社会中最常见的营养障碍性疾病,而由之引发的心、脑卒中及癌症等疾病已成为威胁当今人类的三大杀手,
肥胖的发病机制一直是医学研究的热点和难点,1994年Zhang等[1]首先从遗传性肥胖小鼠(ob小鼠)中克隆出ob基因,使人类对摄食和能量代谢的研究提高到分子水平。ob基因产物瘦素与下丘脑α促黑素细胞激素(melanocyte stimulating hormone, MSH)受体结合,在调节能量代谢上发挥双重作用,即抑制食物摄入和增加能量消耗。人类豚鼠相关蛋白(human agouti-related protein,hAGRP)是α-MSH受体的内源性拮抗剂,阻遏了α-MSH的作用,引起食欲增强及肥胖[2]。最近研究发现hAGRP基因编码区内760G/A的多态性。Vink等[3]报道760G/A多态性与神经性厌食有关,而Dubem等[4]未发现其与体重有显著联系。本研究旨在研究超重和肥胖与AGRP基因多态性的关系。
一、对象和方法
1 对象
233名研究对象来源于2003年1月至2004年10月到本院神经精神科和武汉市中心医院神经内科就诊的患者,均为中国汉族成人,相互间无血缘关系,其中男126名,女107名,平均年龄(58.5+7.8)岁。所有对象排除急慢性心脑血管疾病、内分泌疾病、糖尿病及肝、肾功能不全等疾病,同意抽血及参加本遗传学研究,并签知情同意书。
2、方法
⑴ 体重指数测定:
研究对象均在检查当天早晨空腹接受检查。采用标准的体重秤,去鞋和减除相应衣服重量后测量身高(cm)和体重(kg)值,计算体重指数(body mass index, BMI),BMI=体重(kg)/身高2(m2)。
⑵ 超重和肥胖标准:
根据中国肥胖问题工作组2001年提供的标准,以BMI数值18.5~23.9为正常值,24.0~27.9为超重者,≥28.0为肥胖者[5]。本研究以BMI≥24者为超重和肥胖组,共135例,其中男71例,女64例;BMI<24者为对照组,共98例,其中男55例,女43例。
⑶ 生化指标检测:
于清晨抽取空腹静脉血,不抗凝,血清分离后测空腹血糖(FBS)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白A(apoA)及载脂蛋白B(apoB)。另一部分血EDTA抗凝用于DNA提取。
⑷ 基因学检查:
①DNA抽取:空腹12小时后,取肘静脉血1mlEDTA抗凝,用DNA抽取试剂盒(V-GENE BIOTECHNOLOGY LIMITED )从150μl静脉血中提取DNA。
②PCR扩增: 50μlPCR反应体系:10×PCR Buffer 5μl, dNTP(10mmol/l)1μl, 上、下游引物 (10pmol/μl)各2μl, MgCl2(25mmol/l)4μl, TaKaRa Taq(5U/μl)0.5μl, DNA 1μg, 去离子水补足50μl。引物序列分别为:引物1, 5'-AGTCTCCCCTGGCATAAACC-3'; 引物2,5'-GTAGTGTCGTCGCTGGTGAG-3'(参考George Argyropoulos的实验,序列由上海博亚生物技术有限公司合成)。反应条件:95℃预变性5min后,94℃变性30s,58℃退火1min,72℃延伸1min循环30次,最后72℃延伸10min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后,在紫外灯下迅速切取291bp特异性条带,使用DNA凝胶回收试剂盒(V-GENE BIOTECHNOLOGY LIMITED)回收DNA。
③多态性检测:Alw26Ⅰ限制性内切酶(购于Fermentas公司)作用于特异DNA片段37℃4h。每个个体的基因型直接通过2%琼脂糖凝胶电泳及0.5μg/ml溴化乙淀(EB)显色鉴定。
⑸ 统计学处理:
采用SPSS11.0软件对数据进行管理和相关分析。各组实验重复3次,计数资料比较采用χ2检验,计量资料用 表示,并行方差分析,直线相关分析。Hardy-Weinberg平衡的吻合度用χ2检验。
表1 两组生化指标比较
指标 超重和肥胖组 对照组
FBS(mmol/L) 5.80+1.29* 4.92+0.36
TC(mmol/L) 4.47+0.53* 4.20+0.49
TG(mmol/L) 1.83+0.19* 1.57+0.23
HDL(mmol/L) 1.14+0.13 1.20+0.21
apoA(g/L) 1.44+0.21 1.39+0.23
apoB(g/L) 0.85+0.18* 0.73+0.18
与对照组比较*P<0.05
表2 BMI与FBS、TC、TG之间的相关性分析
指标 BMI
r P
FBS 0.379 <0.05
TC 0.211 >0.05
TG 0.296 <0.05
二 结果
1、两组生化指标比较
两组间年龄、性别构成比无明显差异。超重和肥胖组FBS、TG、TC和apoB均较对照组明显增高(见表1)。
2、BMI与FBS、TC、TG之间的相关性分析
超重和肥胖组BMI与FBS、TG呈正相关(见表2)。
2、两组基因型及等位基因频率的比较
琼脂糖凝胶电泳所得结果清晰,重复性良好。部分患者AGRP760G/A多态性通过酶切检测结果如图1。等位基因760A处可以被Alw26Ⅰ酶切成129bp、162bp两个片段,而等位基因760G则不能切开,仍为291bp的片段,故该位点的杂合子出现三条带(见图1)。实际观察基因型频率与预期频率基本一致(P>0.05),符合Hardy-Weinberg平衡法则。结果显示总研究人群中hAGRP基因的760A和760G两种等位基因分布频率为2.79%和97.21%;超重和肥胖组与对照组G等位基因均占多数(分别为98.52%和95.41%),超重和肥胖组G基因频率比对照组高,χ2检验二组等位基因频率有显著差异(P<0.05)。超重和肥胖组与对照组基因型分布均以G/G型纯合子为主(分别为97.03%和90.82%),二者比较有显著性差异(P<0.05),超重和肥胖组G/G基因型频率比对照组高。超重和肥胖组与对照组G/A基因型分别为2.97%和9.18%,两组均未发现A/A型纯合子。(见表3)。
表3 两组基因型及等位基因频率的比较
组别 例数 基因型(%) 等位基因(%)
760G/G 760G/A G A
超重和肥胖组 135 131(97.03) * 4(2.97) 266(98.52) * 4(1.48)
对照组 98 89(90.82) 9(9.18) 187(95.41) 9(4.59)
与对照组比较*P<0.05
三 讨论
肥胖得发生发展是遗传、环境和生活方式等多种因素相互作用得结果,是多因素引起得复杂疾病。遗传度研究表明人类体重变异70%由遗传因素决定。下丘脑在调节人体能量代谢和体重平衡方面起着重要作用,AGRP表达于下丘脑弓状核,有潜在的食物摄取和合成代谢的作用。
1、AGRP在肥胖的发生中的作用和机制
瘦素是ob基因的产物,由脂肪细胞分泌,经血循环通过血脑屏障进入下丘脑,与受体结合发挥瀑布式作用。中枢黑色素皮质激素(melanocortins, MC)系统和豚鼠相关蛋白(AGRP)表达于下丘脑弓状核神经元,位于瘦素的下游,是瘦素信号传导的主要通路。MC系统是由共同前体阿片促黑素皮质(POMC)裂解而来的,而目前研究最多的是α-MSH。α-MSH在垂体和下丘脑含量最高,脑内其他部位亦有分布,其中以中隔、视前区、下丘脑背内侧核、室周核含量较高,而在中枢神经系统以外,如皮肤、心肌细胞、肌纤维、肌纤维内神经末梢等外周组织中均可检测出。其作用有控制肤色、调节内分泌功能(包括控制肥胖、促进生长激素的分泌、调节醛固酮的分泌、抑制促肾上腺皮质激素释放等)。α-MSH是MC受体激动剂,可与MC3-R、MC4-R结合,在抑制食物摄入及增加能量消耗上起重要作用。AGRP也可与下丘脑MC3-R、MC4-R结合,是MC受体的竞争性拮抗剂,阻遏了α-MSH的作用,引起食欲增强及肥胖。瘦素可上调POMC表达和抑制AGRP表达,同时AGRP也对瘦素起负反馈作用。动物实验已证实AGRP与肥胖有关,当转基因鼠过度表达或侧脑室内注入AGRP时,细胞内固定Ca2+及组织间Ca2+皆升高,导致脂源性基因表达及脂肪合成增加、分解受抑制,引发肥胖。因此AGRP是一种重要的食欲肽。
2、AGRP的基因多态性
hAGRP含132个氨基酸残基,在下丘脑弓状核、肾和肾上腺表达。hAGRP基因位于16号染色体,相对较小,从开始的非编码外显子起约有1218个碱基,包括3个编码的外显子coding exons和上游一个未编码的外显子upsteam non-coding exon。DNA测序发现共有3种基因多态性,第1种是760G/A,位于外显子3,使AGRP氨基酸发生转换Ala67Thr。第2种为外显子2的静息多态性526G/A,第三种为内含子2的多态性650C/T。DNA测序发现共有3种基因多态性,第1种是760G/A,位于外显子3,使AGRP氨基酸发生转换Ala67Thr。第2种为外显子2的静息多态性526G/A,第三种为内含子2的多态性650C/T。最近报道肥胖者血清hAGRP升高,AGRP基因编码区内的760G/A多态性与摄食有关,而且这种多态性对蛋白质二级结构造成影响,虽然AGRP的蛋白活性区域在83-132位氨基酸,Ala67Thr不在此区域,但二级结构分析发现760G→A突变发生时蛋白质构象不同。在本研究中,两组基因型分布有显著差异(P<0.05),超重和肥胖组G/G基因型频率比对照组高;二组等位基因频率亦有显著差异(P<0.05),超重和肥胖组G基因频率比对照组高。因此我们认为hAGRP存在760G/A多态性,且G等位基因与成人肥胖相关。
3、肥胖与高血糖、高血脂的关系
肥胖很早就被定义为易患多种疾病得高危因素,已被证实它是高血压、糖尿病和心脑卒中最主要的危险因素之一,BMI与冠心病、总脑卒中和缺血性卒中有独立的关联,BMI每增加2kg/m2,冠心病、脑卒中和缺血性卒中的发病危险分别增高15.4%、6.1%和18.8%。本研究亦证实超重和肥胖组BMI与FBS、TG呈正相关,肥胖患者血TG、TC和apoB均较对照组明显增高(P<0.05),而他们是心、脑卒中的高危人群。因此我们在人群中尤其是中老年人群控制体重对于高血糖、高血脂的防治,乃至进一步预防心、脑卒中是十分有意义的。
4、AGRP基因760G/A多态性研究对肥胖的意义
随着我国经济水平持续增长和人口老龄化的国情,肥胖人口以惊人的速度增长,1992年北京居民肥胖率男性由2.9%增长至7.4%,女性由6.0%增长至9.6%,预计5~10年后我国肥胖人口比例就会达到西方国家现有水平。AGRP被证实不仅与食物摄取还与食物的选择有关,实验证实注入AGRP后鼠更倾向于高糖、高脂饮食,提示AGRP与高热量食物的摄取相关,但是不是760A等位基因可使个体选择特定的食物以降低BMI和体脂尚有待进一步研究。